生物医药品聚合体分析系统 Aggregates Sizer - 特点

为什么使用激光衍射·散射法可以测定以浓度（μg/mL)形势给出的粒径分布?

样品A和B 为不同浓度的同种颗粒，用常规的激光粒度测定时，只能得到相同的粒度分布数据，而不能发现浓度的不同。Agg regates S i zer系统能够进一步分析与颗粒波度成正比的光强度数据，并通过聚苯乙烯标准颗粒所制作的标准曲线进行校准，可进一步获得以浓度（单位：μg/mL）形式给出的粒度分布数据。

激光ー衍射·散射法（Laser Diffraction Method）的测定原理

● 粒径与光强度分布模式之间存在1对1的关系。

激光束照射颗粒后，从粒子向前后·上下·左右的所有方向发出衍射· 散射光。衍射·散射光的强度随散射角度的变化而变化，存在特定的强度空间分布模式。简称为光强度分布模式。

粒径较大时，从颗粒发出的衍射· 散射光集中在前方(激光束的前进方向) ，在正前方的较小角度范围内发生较大的强度波动，而与正前方的光相比，其他方向的光非常弱。随着粒径小，衍射·散射光的强度分布从正前方向四面八方扩展。如果粒径进一步减小，侧面光与后方光进一步变强。此时，光强度的分布模式， 形成好似蚕茧或葫芦的形状，向所有方向扩展。因此，粒径与光强度分布模式之间存在着一一对应的对应关系， 如果检测得到光强度分布模式经过计算就可以得知粒径。

● 采用蓝紫色激光，准确测定小粒子。

粒径变小时，即使粒径发生变化，光强度分布模式也几乎没有变化。这是激光衍射式粒径分布测定装置存在检测限的原因。如果使用蓝紫色激光，与红色激光相比，即使更小的粒子也看明确地表现出光强度分布模式的差异。

● 测定对象是粒子群。

在实际的粒径分布测定中，测定对象不是单一的颗粒而是由大量颗粒物构成的颗粒群，颗粒群中存在不同尺寸的颗粒，颗粒群的光强度分布模式是各个颗粒发出的衍射· 散射光的叠加。通过检测、解析此叠加光的强度分布模式， 可以求出各尺寸颗粒的比例，即粒径分布。这是激光衍射式粒度分布测定装置测定粒度的基本原理。

● Aggregates Sizer 的光学系统

光源发出(半导体激光) 的激光束通过准直仪变换为粗的平行束后照射颗粒群。从颗粒群发出的前向衍射· 散射光通透镜，在焦平面上形成同心圆状的衍射· 散射像，由同心圆状的Wi 门9 川传感器进行检测。侧面、后方的散射光则由侧方以及后方散射光传感器进行检测。所有方向的光强度数据汇总之后即为光强度分布数据。

● 光强度检测与数据处理的流程

激光衍射式粒度分布测定装置基于光强度分布数据计算粒径分布。检测及数据处理的流程如左图所示。测定时，在同一时间进行从衍射·散射光的光强度分布模式检测到粒径分布的计算，然后输出拉径分布数据。粒径分布再计算功能可利用之前保存的光强度分布数据，选择与测定时不同的折射率，进行粒径分布的再计算。

常规的激光衍射散射法粒度只能获得粒度分布数据，而Aggregates Sizer系统中可以通过光强度变化进一步获得浓度数据(Unit:g/mL)

SVP区域的粒径测定只需一台装置

使用生物医药品聚合体分析系统专用软件WingSALD bio，以纵轴表示浓度（μg/mL），进行定量性测定。

测定结束后，测定数据被追加到数据显示一览表中，可以进行数据确认・解析以及与其他已读入数据的比较。

上图是下面2个图的重绘图。2个图是粒径分布的累积图与差分图。累积图以折线表示，所有粒径小于横轴表示粒径的粒子的累积量，作为纵轴数值Q（μg/mL）表示。差分图以柱状图表示，横轴表示粒径范围内所含粒子量，作为纵轴数值q（μg/mL）表示。

高浓度线性

聚苯乙烯乳胶1μm的测定结果
（样品浓度：0.1ppm, 0.5ppm, 1ppm, 2,5ppm, 5ppm）

横轴为样品实际浓度，纵轴为样品测定浓度，图中可见Aggregates Sizer测定0.1ppm, 0.5ppm, 1ppm, 5ppm 和10ppm的良好线性。

高重现性

为实现激光衍射·散射法测定的高重现性，建立了准确捕捉样品衍射·散射光的稳定的光学系统。

下表表示改变聚苯乙烯乳胶1μm样品的浓度（0.5ppm, 1ppm, 2.5ppm, 5ppm）进行重复测定的结果。
按样品浓度计算的CV值都进入3％以内。

高分辨率，准确检测多个峰的粒径分布

大颗粒的散射光强度高，并在光轴附近波动较大，而小颗粒的散射光较弱，在较大角度范围内的缓慢变化。

Aggregates Sizer 采用Wing SensorII正前方检测器，78个检测器元件从中心到外围呈同心圆分布且面积按照对数比例增加。因此， Wing SensorII检测器能够高分辨率的测定宽范围粒径分布所产生散射光的强度分布。

从以上图表中, 可以得到聚苯乙烯1μm颗粒的浓度是9.114 μg/mL，用总浓度12.667μg/mL 减去9.114可得到聚苯乙烯5μm颗粒的浓度是3.553μg/mL。

定量性测定SVP区域的粒子量

■ 改变pH时γ球蛋白的粒径分布与粒子量的变化

表示将γ球蛋白分散于纯水、邻苯二甲酸缓冲液（pH4）、磷酸缓冲液（pH7.4）中时的粒径分布和粒子量（浓度：1 mg/mL）。

聚合粒子多分布在1μm至10μm之间，SVP区域的粒子量在纯水中分散时最多，约4.4μg/mL，磷酸缓冲液时最少，约0.4μg/mL，相差10倍以上。

使用的检测池

一次性样品池
可测定样品量0.4mL。

 

定量性确认聚合体随时间的变化

■最多可连续测定15小时

连续定量测定最小间隔为1秒。因此，能够有效分析亚可见聚合体颗粒的时间序列变化（大小和浓度） ，以及聚合之前和之后样品状态之间的差异。如未出现较大差异，即可确认样品的稳定性。

通过机械刺激加速聚合反应过程

■长达几天的聚合反应过程分析能够被大大缩短

微量样品池的搅拌功能能够实现对聚合体的机械刺激，可有效加速分析过程而无需额外的附件和软件。这一功能可以用于蛋白质的聚合特性的筛查。

■加入L-精氨酸抑制聚合过程

上述实验结果证明添加L-精氨酸可抑制牛血清白蛋白溶液（Tris缓冲液PH5）的聚合。这一实验过程可利用微量样品池的搅拌功能进行加速，显著减少观测所需时间。测定的总粒子量与搅拌时间的关系如Fig.1所示。可知由于添加L-精氨酸，形成的聚合体量减少。

使用的检测池

微量样品池SALD-BC75
最少液量为5mL。配备四氟乙烯树脂漏斗，悬浮液粘在手上的可能性小，不污染检测池表面。

■通过机械性刺激评价聚合体形成

本图显示在磷酸缓冲液(PH7.4）中分散并不断搅拌的丙种球蛋白聚合的时间序列变化。搅拌时间：0，10，20，和30分钟。丙种球蛋白的浓度为1mg/mL，搅拌30分钟后亚可见聚合体颗粒的浓度从0.4mg/mL增加到2.2mg/mL，增加了4倍。

使用的检测池

微量样品池SALD-BC75
最小液量为5mL。 可通过搅拌板的上下运动对样品进行机械刺激。

生物医药品聚合体分析系统Aggregates Sizer有以下单元组成。

可测定0.1ppm浓度的样品
纳米激光粒度仪

SALD-7500nano

 

• 光源采用蓝紫色半导体激光（波长405nm）。无需气体更换等一切维护工作。
• 检测器前方配置78个元件、侧方1个元件，后方5个元件共计84个元件。并且，全部采用对应蓝紫色半导体激光波长的高灵敏度受光元件。
• 检测池、检测池架的固定部分采用滑动方式，可向前拉出，检测池的安装、更换以及维护非常方便。
• 采用WingSALD bio软件，可以进行丰富多彩的数据处理，操作简单快速。

 

外形尺寸图

样品量0.4mL即可测定
一次性样品池

 

• 能够以激光衍射·散射法进行高浓度样品的粒径分布测定。
• 只需将高浓度粒子样品夹在2枚载玻片中即可进行测定。
• 对于由于稀释造成粒径分布变化的样品，可以直接使用原液或进行最小限度的稀释即可进行测定，从而实现更为准确的测定。

 

什么是高浓度样品测定？

测定高浓度样品时，如果使用通常的流通池或微量样品池，则光程变长，发生多重散射，不能进行正确的测定。岛津使用2枚玻璃板（载玻片）夹入样品，可以彻底地缩短光程，避免多重散射的不良影响，实现正确测定。

并且，通过相对于光轴倾斜地配置载玻片，还可进行侧方散射光的检测。将侧方散射光与前方及后方散射光一同用于粒径分布计算，可以实施微粒子／超微粒子的高浓度样品测定。

应用搅拌功能进行聚合体测定。
批量检测池SALD-BC75

 

• 能够以少量样品（测定目标粒子）和分散介质进行测定。
• 微量样品池的容量仅5mL，悬浮液废液处理量小。
• 搅拌板的上下运动抑制粒子沉降。
• 使用漏斗防止样品溢出。
• 配备四氟乙烯漏斗，悬浮液粘在手上的可能性小，不污染检测池表面。