前沿合作 | 一种利用LCMSMS进行药物代谢酶同时定量分析的简易方法

　　代谢是机体处理外源性物质(药物、毒物等)的重要生理过程，通常通过一系列酶促反应对外源性物质进行转化，最终排出体外。细胞色素P450酶可介导大多数代谢反应，存在于肝脏、胃肠道、肾脏、胎盘、大脑等多种器官中，易受遗传及环境因素的影响，在不同种族、个体、组织及亚器官中存在分布、表型及功能差异。一种酶通常可参与多种药物的消除过程，其丰度在药物相互作用及特定人群的精准医疗研究中十分重要。

　　目前基于生理药代动力学研究(Physiologically Based Pharmacokinetic, PBPK)的方法已经成为被广泛接受的药物研发工具并用于支持临床研究。PBPK模型集合了一系列解剖和生理学参数以形成具有明显特征的组织隔室，从而系统性进行药物体内代谢过程预测。酶丰度是PBPK模型的重要参数之一，本研究利用液相色谱三重四极杆液质联用系统LCMSMS开发同时定量检测7种细胞色素P450酶(CYP450)的方法，7种目标药物代谢酶为FDA指南推荐应用于临床前及临床研究的CYP450酶。该方法可应用于不同的人组织来源样品如胎盘、肝微粒体等酶丰度的检测，实现药物代谢酶的高特异性、高灵敏度检测。

实验条件

　　本工作使用岛津LC-30A系统+LCMS-8060三重四极杆液质联用系统进行方法开发及验证。

图1 岛津液相色谱三重四极杆串联质谱平台

　　LC分离参数

　　流动相A：水+0.2%甲酸；流动相B：乙腈+0.2%甲酸；流动相C：乙腈+0.5%乙二醇+0.2%甲酸，为提高目标代谢酶检测灵敏度，在柱后以0.1mL/min流速输送流动相C。

　　色谱柱：Shim-pack GISS-HP C18 (2.1mm*100mm, 1.9μm)

　　流速：0.3mL/min

　　柱温：35℃

　　进样量：10μL

表1  LC梯度洗脱程序

　　质谱检测参数

　　离子化模式：ESI，正离子模式；

　　雾化气：3L/min;

　　干燥气：8L/min;

　　加热气：12L/min;

　　接口温度：350℃；

　　脱溶剂管线DL温度：250℃；

　　加热模块温度：400℃。

表2 目标转运体蛋白及MRM检测参数

实验结果

　　图2显示空白基质（添加内标）以及空白基质添加7种目标CYP药物代谢酶及其对应内标的离子流图，7种代谢酶得到良好的分离，且无明显干扰。该方法的定量限、线性范围以及相关系数如表3显示。

图2 7种代谢酶离子流图(A. 空白基质+内标；B. 空白基质+目标代谢酶+内标)

表3  7种代谢酶定量检测方法定量限、线性及相关系数 (权重：W=1/C2)

　　方法日内准确度及精密度结果如表4所示，LQC、MQC以及HQC的日内平均准确度为94.41%到106.56%，对应CVs为3.24%-14.67%， LLQC平均准确度为93.89%-103.33%，CV小于20%。

表4  日内准确度及精密度结果

　　对该检测方法的稳定性进行考察，使用LQC及HQC进行短期稳定性及长期稳定性考察，结果显示目标特定肽段可在室温稳定12小时，在-20℃稳定30天，而在4℃也可稳定30天。表5显示了方法稳定性检测结果。

表5  日内准确度及精密度结果

　　使用该方法对人胎盘组织及肝脏微粒体样品中目标药物代谢酶丰度进行检测，其结果如表6及表7所示。

表6  胎盘组织中CYP3A4丰度检测结果

表7  混合人肝微粒体样品中7种CYP450蛋白丰度检测结果

小结

　　本工作成功建立了一种可灵敏进行7种CYP450酶同时定量分析的LCMSMS方法，该方法可应用于检测不同人组织样品中CYP450酶的丰度，从而为PBPK研究提供重要研究数据及参考依据。

　　本工作详细内容已由北京大学第三医院药物临床试验机构刘东阳研究员课题组发表于Journal of Chromatography B. 1214(2023)123536.